Articolo

Enrico Bucci

Un farmaco disegnato sulla forma di una proteina

Qualche giorno fa, al congresso annuale dell’American Society of Clinical Oncology, sono stati presentati nuovi dati su lorlatinib, un farmaco già approvato per un sottotipo di carcinoma polmonare non a piccole cellule guidato da ALK. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule comprende la maggior parte dei tumori del polmone. ALK è una chinasi, cioè una proteina che modifica altre proteine aggiungendo gruppi fosfato e, in questo modo, regola segnali cellulari legati alla crescita, alla sopravvivenza e al movimento delle cellule. In una piccola quota di tumori polmonari, un riarrangiamento del DNA altera la regolazione di ALK e fa sì che la proteina ALK rimanga accesa in modo anomalo. Il tumore dipende da quel segnale alterato. Per questo si parla di tumore ALK-positivo: la malattia viene definita da una lesione molecolare legata a quella proteina, che può essere cercata, misurata e colpita con un farmaco.

Proprio perché questo tumore dipende in larga misura dall’attività aberrante della chinasi ALK determinata dall’alterazione genetica che la coinvolge, questa alterazione è diventata rapidamente un bersaglio farmacologico. L’idea è semplice: se la crescita del tumore è sostenuta da una chinasi costitutivamente attiva, bloccare quella chinasi dovrebbe interrompere il segnale da cui la malattia dipende. Da questa intuizione è nata una successione di farmaci diretti contro ALK. Crizotinib è stato il primo a dimostrare che questa strategia funzionava nei pazienti, aprendo la strada allo sviluppo di inibitori sempre più potenti e capaci di superare i limiti emersi con l’esperienza clinica, come le mutazioni di resistenza e la progressione nel sistema nervoso centrale. Lorlatinib, che qui discuteremo, appartiene a questa generazione più avanzata di inibitori di ALK.

I risultati presentati all’ultimo convegno si riferiscono allo studio CROWN, che ha confrontato lorlatinib con crizotinib, il primo farmaco che aveva trasformato ALK in un bersaglio terapeutico efficace nel carcinoma polmonare. I pazienti arruolati avevano malattia avanzata ALK-positiva e ricevevano il trattamento in prima linea, cioè prima di altre terapie per la fase metastatica. La misura principale era la sopravvivenza libera da progressione tumorale, indicata spesso con la sigla PFS. La PFS è il tempo durante il quale, in un trial, il paziente resta vivo senza che la malattia mostri una crescita documentata secondo criteri stabiliti dal protocollo. Dopo circa sette anni di osservazione, i ricercatori hanno visto una differenza enorme tra i due farmaci. Con crizotinib, il tempo dopo il quale metà dei pazienti aveva già avuto una ripresa della malattia era di circa nove mesi. Con lorlatinib, invece, questo punto non era ancora stato raggiunto nemmeno dopo sette anni di follow-up. In pratica, significa che più della metà dei pazienti trattati con lorlatinib era ancora viva senza peggioramento del tumore al momento dell’analisi. A sette anni, il 55% dei pazienti trattati con lorlatinib era ancora libero da progressione, contro il 3% dei pazienti trattati con crizotinib. L’hazard ratio era 0,19, un indicatore che confronta il rischio istantaneo di un evento nei due gruppi durante il periodo osservato; e un valore di 0,19 indica che, nel gruppo lorlatinib, il rischio relativo di progressione o morte era ridotto di circa l’81% rispetto al gruppo crizotinib.

Non basta. Nei tumori ALK-positivi il cervello è una sede frequente di progressione. Questo accade anche perché molti farmaci raggiungono con difficoltà il tessuto cerebrale. La barriera emato-encefalica è formata dalle cellule dei piccoli vasi cerebrali e da sistemi di trasporto che regolano l’ingresso delle molecole dal sangue al cervello. In condizioni normali protegge il sistema nervoso; nella terapia oncologica può impedire a un farmaco di arrivare in quantità sufficiente proprio dove il tumore ha formato metastasi. Con lorlatinib, nello studio CROWN, dopo i primi trenta mesi non sono stati osservati nuovi eventi di progressione intracranica. Il tempo mediano alla progressione intracranica non era ancora raggiunto con lorlatinib, mentre era 16,4 mesi con crizotinib. A sette anni, la quota di pazienti liberi da progressione intracranica era 92% con lorlatinib e 16% con crizotinib. In termini clinici, il dato indica un controllo prolungato della malattia anche nel compartimento cerebrale, che per questa forma di tumore rappresenta uno dei problemi più difficili.

E gli effetti collaterali? Lorlatinib non è un farmaco privo di tossicità e i risultati molto favorevoli sull’efficacia vanno letti insieme a questo aspetto. Negli studi clinici gli effetti indesiderati più frequenti sono stati l’aumento del colesterolo e dei trigliceridi nel sangue, spesso abbastanza marcato da richiedere farmaci specifici per il controllo dei lipidi. Sono comuni anche edema, aumento di peso, neuropatia periferica e alterazioni neuropsichiatriche. La neuropatia periferica è un disturbo dei nervi periferici che può causare formicolii, riduzione della sensibilità, dolore o difficoltà nei movimenti fini. Gli effetti sul sistema nervoso centrale possono includere rallentamento cognitivo, difficoltà di concentrazione, problemi di memoria, alterazioni del linguaggio, cambiamenti dell’umore, irritabilità, ansia o, più raramente, sintomi psichiatrici ancor più importanti. In alcuni pazienti questi effetti portano a riduzioni della dose, sospensioni temporanee o interruzione del trattamento.

Gli eventi avversi vengono classificati per grado: 3 o 4 indica tossicità severe o clinicamente rilevanti. Quando Pfizer afferma che il profilo di sicurezza è rimasto “coerente” con le analisi precedenti non significa che gli effetti collaterali siano pochi o trascurabili; significa piuttosto che, con un follow-up più lungo, non sono emersi nuovi segnali di tossicità inattesi rispetto a quelli già conosciuti. La domanda clinicamente importante non è quindi se lorlatinib abbia effetti collaterali – li ha, e alcuni possono essere impegnativi – ma se il beneficio ottenuto li compensi. Nei pazienti con tumore ALK-positivo avanzato, i dati di efficacia suggeriscono che per molti la risposta è sì, soprattutto considerando la durata del controllo della malattia e la protezione dal coinvolgimento cerebrale. Un aspetto rassicurante emerso dalle analisi presentate è che la riduzione della dose, utilizzata nella pratica clinica per gestire effetti collaterali come alterazioni cognitive, neuropatia, edema o disturbi metabolici, non sembra compromettere in modo significativo l’efficacia del trattamento. I pazienti che hanno richiesto un aggiustamento della dose hanno mantenuto risultati clinici ampiamente sovrapponibili a quelli osservati nella popolazione complessiva, suggerendo che una calibrazione personalizzata della terapia possa migliorare la tollerabilità senza sacrificare il controllo della malattia. Questo dato è particolarmente importante per un farmaco destinato a essere assunto per periodi molto lunghi, perché offre ai clinici uno strumento concreto per ridurre il peso degli effetti indesiderati mantenendo il beneficio terapeutico.

Un altro risultato presentato ad ASCO riguarda LORIN, uno studio di fase 2 su lorlatinib in pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule ALK-positivo di stadio III, una malattia localmente avanzata: il tumore resta nel torace e nei linfonodi regionali, con situazioni diverse per estensione, operabilità e rapporto con le strutture anatomiche vicine. In LORIN, lorlatinib è stato usato come trattamento neoadiuvante, ovvero somministrato prima dell’intervento chirurgico o di un trattamento locale con l’obiettivo di ridurre la massa tumorale, rendere più favorevole la chirurgia e colpire cellule tumorali già presenti ma ancora non evidenti nelle immagini. I pazienti hanno ricevuto tre cicli di terapia. Una parte di loro è arrivata alla chirurgia; altri hanno continuato con un farmaco della stessa classe o sono stati indirizzati alla radioterapia.

I risultati di LORIN sono importanti perché misurano l’effetto di lorlatinib direttamente sul tessuto tumorale rimosso. La risposta radiologica obiettiva, cioè la riduzione del tumore osservata con le immagini secondo criteri standard, è stata dell’83,7%. Fra i pazienti sottoposti a chirurgia, la resezione R0 è stata ottenuta nel 96,9% dei casi. R0 significa che, all’esame del pezzo operatorio, i margini di resezione risultano liberi da tumore: il chirurgo ha asportato tutto il tumore identificabile e, quando il tessuto rimosso viene analizzato al microscopio, non si osservano cellule tumorali a contatto con il bordo di taglio. In altre parole, non ci sono segni che la malattia sia rimasta nel punto in cui è stata eseguita la resezione. La risposta patologica completa, indicata con pCR, è stata del 46,9%. In questi casi, il patologo non trova cellule tumorali vitali nel campione chirurgico valutato. La risposta patologica maggiore, MPR, è stata dell’81,3%; questa espressione indica una quantità molto bassa di tumore vitale residuo nel tessuto asportato. Il downstaging linfonodale patologico, cioè la riduzione del coinvolgimento dei linfonodi documentata all’esame istologico rispetto alla valutazione iniziale, ha raggiunto il 90,6%. Fra i pazienti inizialmente considerati non operabili, il 75% è stato convertito alla chirurgia dopo lorlatinib. Con un follow-up mediano ancora breve, tredici mesi, la sopravvivenza libera da eventi a un anno era 97,1%. 

LORIN resta uno studio piccolo, di fase 2, senza confronto randomizzato con un gruppo di controllo. Questa precisazione limita l’interpretazione, ma non svuota il risultato. Uno studio di fase 2 serve a capire se il segnale biologico e clinico giustifica verifiche più grandi. Qui il segnale riguarda una terapia mirata capace, in poche settimane, di ridurre in modo profondo la vitalità del tumore in una malattia localmente avanzata. Questo significa che lorlatinib non va letto soltanto come farmaco per la malattia metastatica. I dati iniziali indicano la possibilità di portare la stessa logica molecolare in una fase più precoce, dove l’obiettivo non è solo ritardare la progressione, ma modificare la traiettoria locale della malattia prima dell’intervento chirurgico.

Per capire da dove venga una molecola capace di produrre questi risultati bisogna tornare a crizotinib. Nacque come inibitore di c-MET, un’altra chinasi coinvolta in segnali oncogenici, e poi mostrò attività contro ALK. Quando i tumori ALK-positivi cominciarono a essere trattati con crizotinib, la risposta clinica confermò che il tumore dipendeva davvero da quella chinasi alterata. Il farmaco entrava nella tasca catalitica di ALK, la regione della proteina dove normalmente si lega ATP, la molecola che fornisce il gruppo fosfato alla chinasi. Bloccando quella tasca, crizotinib impediva ad ALK di trasferire fosfati ai propri bersagli e riduceva i segnali di crescita. La malattia, però, sviluppava resistenze. Alcune cellule tumorali acquisivano mutazioni nel dominio chinasico di ALK, cioè nella porzione della proteina che contiene la tasca catalitica. Una mutazione può cambiare un singolo amminoacido, ma in una proteina ripiegata nello spazio quel cambiamento può modificare il volume della tasca, la distribuzione delle cariche, la possibilità di formare legami a idrogeno o la distanza fra gruppi chimici essenziali. Una delle mutazioni più note è L1196M, chiamata gatekeeper perché si trova in una posizione che controlla l’accesso a una zona profonda del sito di legame. Altri pazienti progredivano nel cervello, dove crizotinib raggiungeva concentrazioni insufficienti.

Sin qui, la clinica. Ma perché parliamo di questi argomenti in questa rubrica? Il punto è che, dietro ogni nuovo trattamento farmacologico, dietro i dati che così tante speranze danno a clinici e pazienti, c’è una molecola; questa volta, una molecola progettata, non frutto dell’evoluzione naturale, ma di quella scientifica.
Per capire cosa significhi davvero “progettare” un farmaco bisogna fare un passo indietro. Per molti decenni la scoperta di nuovi medicinali è avvenuta soprattutto per tentativi: si sintetizzavano o si isolavano molte molecole diverse e si osservava quali producessero un effetto biologico utile. Il rational drug design, cioè la progettazione razionale di farmaci, segue una logica diversa. Invece di partire da una molecola e chiedersi cosa faccia, si parte da un problema biologico ben definito e ci si chiede quale molecola potrebbe risolverlo.

Per fare questo bisogna conoscere il bersaglio molecolare della malattia. Nel caso dei tumori ALK-positivi, il bersaglio è la proteina ALK alterata. Una proteina non è un oggetto astratto: è una struttura fisica composta da migliaia di atomi organizzati nello spazio. La sequenza di amminoacidi si ripiega in una forma tridimensionale precisa, creando superfici, cavità, tasche e regioni con proprietà chimiche differenti. Alcune zone attirano molecole cariche positivamente, altre quelle cariche negativamente; alcune preferiscono ambienti acquosi, altre ambienti più simili ai grassi. La funzione della proteina dipende da questa architettura.

Le chinasi come ALK possiedono una regione particolare chiamata sito catalitico, il punto in cui si lega ATP, la molecola che fornisce il gruppo fosfato necessario alla reazione chimica. Se si riuscisse a occupare quello spazio con un’altra molecola, ATP non potrebbe più entrare e la chinasi smetterebbe di funzionare correttamente. L’idea di base è semplice: costruire una molecola che si inserisca nel sito catalitico meglio di quanto riesca a fare ATP stesso.

Qui entra in gioco il concetto di ligando. Un ligando è qualsiasi molecola capace di legarsi a una proteina. Un farmaco è efficace quando il suo legame con il bersaglio è sufficientemente forte e selettivo. Forte significa che la molecola rimane associata alla proteina abbastanza a lungo da bloccarne la funzione. Selettivo significa che non si lega con la stessa efficacia a molte altre proteine dell’organismo, perché questo aumenterebbe il rischio di effetti indesiderati.

Per progettare un ligando bisogna conoscere nel dettaglio la forma del bersaglio. Tecniche come la cristallografia a raggi X o la crio-microscopia elettronica permettono di ricostruire la disposizione degli atomi nella proteina. Una volta ottenuta questa mappa tridimensionale, i ricercatori possono osservare quali regioni della tasca siano disponibili per il legame, quali atomi possano formare legami a idrogeno, dove siano presenti cariche elettriche e quali spazi possano accogliere gruppi chimici aggiuntivi.

A questo punto inizia un processo iterativo. Si parte da una molecola che mostra una certa attività contro il bersaglio. Attraverso modelli computazionali si cerca di prevedere come quella molecola si posizioni nella tasca della proteina e quali interazioni stabilisca. Se una parte della molecola non contribuisce al legame, può essere modificata o eliminata. Se una regione della tasca resta inutilizzata, si può aggiungere un gruppo chimico capace di occupare quello spazio. Dopo ogni modifica la nuova molecola viene sintetizzata in laboratorio e testata sperimentalmente. I risultati ottenuti guidano il ciclo successivo di progettazione.

L’obiettivo non è soltanto aumentare la capacità di legarsi alla proteina. Un farmaco deve anche raggiungere il bersaglio all’interno dell’organismo. Deve essere assorbito, distribuirsi nei tessuti corretti, resistere abbastanza a lungo al metabolismo, evitare di essere eliminato troppo rapidamente e, nel caso di lorlatinib, attraversare la barriera emato-encefalica per raggiungere il cervello. Per questo il rational design non ottimizza una sola proprietà alla volta, ma cerca un equilibrio fra molte caratteristiche diverse, spesso in competizione tra loro.

Nel caso di ALK, un lavoro pubblicato nel 2014 sul Journal of Medicinal Chemistry documenta questo percorso. I ricercatori partirono da ligandi già noti e attivi contro ALK. Grazie alle strutture tridimensionali dei complessi fra proteina e ligando, analizzarono nel dettaglio come queste molecole si inserivano nella tasca catalitica e quali modifiche potessero migliorarne le proprietà. Osservando le strutture cristallografiche notarono che, una volta legati ad ALK, alcuni di questi ligandi assumevano sempre una conformazione molto simile. In altre parole, la proteina costringeva il ligando a piegarsi in una forma preferita. Da questa osservazione nacque l’idea di creare una molecola chiusa ad anello, cioè un macrociclo: se due porzioni della molecola risultavano vicine nello spazio quando il ligando era legato alla proteina, si potevano collegare con un ponte chimico e chiudere la struttura in un anello. In questo modo si cercava di “congelare” la conformazione già favorita dal bersaglio, riducendo il costo energetico necessario per adottarla al momento del legame. Un macrociclo, quindi, non è soltanto una scelta estetica di chimica molecolare: serve a limitare la libertà di movimento della molecola e a mantenerla più vicina alla forma con cui si lega efficacemente ad ALK. Una molecola aperta può assumere molte conformazioni diverse e deve trovare quella giusta al momento dell’interazione con la proteina; una molecola chiusa ad anello arriva invece già orientata verso la conformazione più favorevole. Lorlatinib nasce proprio da questa idea: trasformare un ligando flessibile in una struttura più rigida e preorganizzata, capace di riconoscere con maggiore efficienza una tasca catalitica che doveva restare accessibile anche quando ALK acquisiva mutazioni di resistenza. Alcune di queste mutazioni modificano la geometria o l’ingombro di regioni cruciali del sito di legame e possono ridurre l’efficacia degli inibitori precedenti. La progettazione di lorlatinib mirava quindi a mantenere un’interazione stabile con ALK anche in presenza di queste alterazioni strutturali.

La macro ciclizzazione non bastava da sola. Una molecola potente contro ALK poteva fallire come farmaco se troppo lipofila, troppo polare, troppo metabolizzata, troppo esposta alle pompe di efflusso o poco selettiva. Lipofilia significa tendenza a sciogliersi in ambienti grassi, e aiuta una molecola ad attraversare membrane cellulari, ma un eccesso può peggiorare solubilità, distribuzione e tossicità. I chimici usarono anche il concetto di efficienza lipofila, che misura quanta potenza si ottiene per unità di lipofilia aggiunta. Questo parametro serve a evitare una scorciatoia frequente nella chimica medicinale: aumentare la potenza rendendo la molecola sempre più grassa, fino a produrre un composto difficile da trasformare in farmaco. La progettazione doveva migliorare insieme potenza, selettività, permeabilità cerebrale, stabilità metabolica e bassa esposizione alle pompe che espellono i farmaci dalle cellule.

Una di queste pompe è la glicoproteina P, indicata spesso come P-gp. È un trasportatore di membrana che usa energia per espellere molte molecole fuori dalle cellule. Nella barriera emato-encefalica, P-gp contribuisce a proteggere il cervello, ma può anche ridurre l’ingresso di farmaci utili. Un inibitore di ALK destinato a controllare metastasi cerebrali deve attraversare le membrane e, allo stesso tempo, non essere espulso troppo rapidamente da questi sistemi. Lorlatinib fu selezionato perché combinava potenza contro ALK, attività contro mutazioni di resistenza, selettività rispetto a molte altre chinasi, proprietà favorevoli per l’ingresso nel sistema nervoso centrale e un profilo ADME compatibile con lo sviluppo clinico. ADME è l’acronimo di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed eliminazione: indica il percorso di una molecola nell’organismo, dal momento in cui viene assunta fino alla sua trasformazione ed espulsione.

La struttura di lorlatinib è utile come esempio perché mostra in modo concreto come una scelta fatta a livello molecolare possa influenzare il comportamento di un farmaco nell’organismo. L’anello macro ciclico orienta nello spazio gruppi chimici che devono incontrare punti specifici della tasca di ALK. Alcuni contatti servono ad ancorare il farmaco nella regione dove si lega ATP; altri permettono di mantenere attività quando la proteina porta mutazioni che ostacolano gli inibitori precedenti. La progettazione non procede per somiglianza generica con una molecola già attiva, ma attraverso cicli successivi di previsione e verifica. La cristallografia a raggi X permette di ricostruire la posizione degli atomi in una proteina cristallizzata con il suo ligando. I modelli computazionali stimano come una modifica cambi il legame, la forma, l’energia dell’interazione o le proprietà chimico-fisiche. La sintesi chimica produce il composto previsto. I saggi enzimatici misurano quanto il farmaco blocca ALK purificata. I saggi cellulari verificano se la molecola spegne il segnale oncogenico dentro cellule vive. Gli studi preclinici valutano metabolismo, distribuzione nei tessuti e ingresso nel cervello. Ogni passaggio elimina composti che sembravano promettenti e conserva quelli che reggono più vincoli contemporaneamente.

Questa sequenza chiarisce il significato dei risultati clinici. Il netto divario nei risultati fra lorlatinib e crizotinib osservato nello studio CROWN non nasce da una superiorità generica di un farmaco più avanzato. Nasce da una progettazione orientata contro problemi già osservati con i farmaci precedenti: resistenza del dominio chinasico, progressione intracranica, necessità di colpire ALK con potenza elevata e selettività sufficiente per un trattamento prolungato. Il dato intracranico, in particolare, è la traduzione clinica di una scelta chimica. Un farmaco progettato per attraversare il sistema nervoso centrale e sfuggire almeno in parte ai meccanismi di efflusso può cambiare il modo in cui la malattia si comporta nel cervello. CROWN misura questo effetto nel tempo lungo della malattia avanzata. LORIN lo porta nella fase neoadiuvante, dove la riduzione profonda della vitalità tumorale viene osservata direttamente nel tessuto rimosso.

A questo punto la storia di lorlatinib diventa un esempio più generale. La medicina ha imparato a guardare il tumore come una massa visibile nelle immagini, come un tessuto riconoscibile al microscopio, come una popolazione di cellule con alterazioni genetiche e come un sistema fisico di proteine, tasche, legami e trasferimenti di energia. Questi livelli non si sostituiscono fra loro; si collegano. La TAC mostra la lesione. L’istologia mostra il tipo cellulare. Il test molecolare identifica la fusione di ALK. La biologia strutturale mostra la forma della proteina alterata. La chimica medicinale costruisce una molecola capace di interferire con quella forma. Il trial clinico misura se questa interferenza produce un vantaggio reale nei pazienti.

La grande lezione della biologia molecolare sta in questo collegamento fra struttura e funzione. La funzione di una proteina dipende dalla sua forma, dalle cariche distribuite sulla sua superficie, dai movimenti che può compiere, dalle molecole che può legare e dalle reazioni che può facilitare. Quando una mutazione cambia uno di questi elementi, può nascere una malattia. Quando un farmaco viene progettato per correggere o bloccare quel funzionamento alterato, la cura agisce allo stesso livello fisico del danno.

La storia di lorlatinib potrebbe sembrare una frontiera della medicina di precisione, ma in realtà rappresenta già una generazione precedente rispetto agli strumenti che stanno emergendo oggi. La progettazione che ha portato a questa molecola si basava su strutture sperimentali, modellistica computazionale e cicli successivi di sintesi e verifica. Oggi l’intelligenza artificiale sta accelerando molti di questi passaggi. Sistemi come AlphaFold e i modelli più recenti per la previsione delle interazioni biomolecolari permettono di formulare e testare ipotesi strutturali con una velocità impensabile fino a pochi anni fa. Gli esperimenti restano indispensabili, perché nessuna previsione sostituisce la verifica biologica e clinica, ma il modo in cui si individuano nuovi bersagli e si progettano nuove molecole sta cambiando rapidamente. 

Lorlatinib mostra cosa si può ottenere quando si comprende una malattia fino alla scala degli atomi, ma anche cosa, più in generale, si può decidere di fare usando il metodo scientifico. Sta a noi spingere perché si ottenga il prossimo proiettile intelligente contro un cancro, e non contro un soldato nemico.